La
capacidad para monitorizar con precisión la liberación de microorganismos
manipulados geneticamente (GEMs) es muy importante para determinar su posible
impacto sobre un ambiente determinado (1). Por esta razón, son esenciales los métodos
sensibles de monitorización para detectar un hospedador y su ADN recombinante
en varios ecosistemas y para valorar cualquier tipo de impacto ambiental (2).
Hay una serie de requerimientos generales para los sistemas marcadores. En
primer lugar el fenotipo expresado no debe ser mostrado por la población indígena.
Por ejemplo, la presencia de bacterias con actividad glucuronidasa en el
ambiente limita la aplicación del sistema marcador gus. Además, el gen
marcador puede estar presente en la población indígena, pero no expresarse,
reduciendo de esta forma la utilización de técnicas basadas en hibridación
por sondas. La eficiencia de estos sistemas requiere el mantenimiento de estos
genes marcadores dentro del hospedador y que los niveles de expresión sean
suficientes para que pueda ser detectado. Mientras que muchos plásmidos que
existen de forma natural son estables sin ejercer ningún tipo de presión
selectiva, los genes marcadores introducidos son generalmente más estables
cuando están integrados en el cromosoma que cuando son codificados por plásmidos.
Esto es particularmente importante para estudios en ambientes donde el
mantenimiento del plásmido por aplicación de condiciones selectivas es a
menudo inapropiado o imposible. Además, hay una posibilidad de que los genes
puedan ser transferidos a organismos no marcados, particularmente si el marcador
es codificado por un plásmido. Muchos investigadores han empezado a adoptar el
uso de mini-transposones para la integración estable en el cromosoma de estos
marcadores (3).
Los sistemas marcadores basados en la bioluminiscencia requieren la introducción
de genes para la emisión de luz. Las enzimas responsables de la producción de
luz se llaman luciferasas. Los organismos más conocidos con la propiedad de
emitir luz son unas bacterias marinas, que pertenecen a los géneros Vibro y
Photobacterium y la luciérnaga de Norte América Photinus pyralis.
Un grupo con enzimas altamente homólogas, con la misma química de catálisis
que la luciferasa de luciérnaga, son las luciferasas de un escarabajo luminoso,
Pyrophorus plagiophtalamus. Estos escarabajos son capaces de producir luz
de hasta cuatro colores diferentes, con picos de emisión de 547 hasta 593 nm.
Los cuatro genes correspondientes han sido clonados y expresados en Escherichia
coli (4). El fenotipo de la luminiscencia ha demostrado ser una herramienta
muy útil para los microbiólogos. Debido a su naturaleza eucariótica (y así
su presumible ausencia de todas las bacterias), los genes de luciérnaga y
escarabajo pueden proporcionar un genotipo único a la bacteria. Por
consiguiente las bacterias marcadas con luciferasas son tambien adecuadas para
poder detectarla con la técnica más sensible en detección bacteriana, PCR
(2). Este nuevo material genético presenta también la posibilidad de
distinguir poblaciones de bacterias no solo por su capacidad para emitir luz,
sino también por el color de la luz emitida. Para explotar esta diferencia en
los ensayos de luciferasa, el gen lucOR se eligió para desarrollar un
nuevo gen marcador ya que esta luciferasa emite luz a una longitud de onda de
595 nm (naranja), que es distinguible a simple vista de la luciferasa de
luciernaga (560 nm) (6).
Las
aplicaciones biotecnológicas que implican la introducción de microorganismos
genéticamente modificados al medio ambiente ha incrementado la necesidad de
nuevos vectores de clonación. Tales vectores necesitan cumplir distintos
criterios que son menos importantes cuando los organismos que los contienen
crecen bajo condiciones controladas. La condición más importante incluye el
mantenimiento estable de las funciones manipuladas en ausencia de presión
selectiva para el vector marcador. Los vectores para el marcado de bacterias están
basados en plásmidos multicopia que transportan los diferentes genes
marcadores. Aunque los plásmidos se pueden mantener en bacterias cultivadas
como monocultivos bajo condiciones controladas, son frecuentemente inestables
cuando los organismos hospedadores crecen en ausencia de presión selectiva para
el mantenimiento del plásmido, como por ejemplo en presencia de antibióticos.
Esta inestabilidad puede ser incrementada cuando la bacteria hospedadora tiene
que competir con otros microorganismos en nichos naturales. Además los
marcadores de resistencia a antibióticos suelen ser indeseables en organismos
que se liberan en grandes cantidades. Por supuesto que es posible aumentar la
estabilidad de los plásmidos en ausencia de presion selectiva mediante uso de
vectores de clonación con autoselección o plásmidos que transportan locus de
estabilización. Sin embargo razas que transportan plásmidos multicopia y
expresan a alto nivel genes presentes en el inserto a menudo compiten pobremente
con otras bacterias que se encuentran presentes en el ambiente. Por ello es
preferible en algunas circunstancias insertar genes clonados en el cromosoma
donde se mantienen a bajo número de copias y donde al menos teóricamente deben
ser tan estables como los genes cromosómicos (6).
Para el marcado de microorganismos en este trabajo hemos utilizado plásmidos de
dos grupos de incompatibilidad. Uno de los plásmidos pertenece al grupo de
incompatibilidad IncP (derivados de RK2) y otro plásmido pertenece al grupo de
incompatibilidad IncW (derivados de R388). El plásmido pRK293 (derivado de
RK2), es un vector de amplio rango de hospedador, con un tamaño de 23Kb y que
codifica para genes de resistencia a la tetraciclina y la kanamicina (7). No es
conjugativo debido a que carece de la región tra. Las diferentes
fusiones con luc y lucOR insertadas en pRK293 se han probado con
éxito en Rhizobium y otras bacterias gram negativas. El plásmido R388
es un plásmido conjugativo del grupo de incompatibilidad IncW, que confiere
resistencia a sulfonamida y trimetoprim, de amplio rango de hospedador y es el más
pequeño de tamaño entre los plásmidos conjugativos que se han estudiado en
enterobacterias (8). Los genes luc y lucOR clonados bajo el control del
promotor derecho del fago lambda se han establecido en el plásmido pSU2007
(derivado de R388), obteniéndose los plásmidos pET1 y pET2 respectivamente.
Los estudios de estabilidad se han realizado tanto en vida vegetativa
(determinación del número de generaciones en medio líquido) como en vida
simbiótica mediante test de nodulación. Los ensayos realizados indican que los
derivados de R388 muestran un 100% de estabilidad en las condiciones analizadas.
Para comprobar la capacidad conjugativa se han realizado experimentos de
transferencia tanto in vitro como en el suelo.
Para el marcaje estable de bacterias gram negativas con genes de luciferasa
eucarióticos hemos utilizado el sistema mini-Tn5 desarrollado por Victor
de Lorenzo (9). El procedimiento desarrollado se ha utilizado para marcar
bacterias gram negativas representativas, como por ejemplo E. coli, R.
meliloti, P. putida, A. tumefaciens, etc. La sensibilidad del
método es tan alta que permitió detectar una colonia marcada de R. meliloti
en placas con más de 105 UFC. No se encontraron diferencias en
cuanto a rango de crecimiento entre la cepa marcada y la estirpe silvestre. Los
estudios de bioluminiscencia en R. meliloti revelaron también una buena
correlación entre biomasa y bioluminiscencia (10). También se han construido
derivados de mini-Tn5 para la introducción y el mantenimiento estable
del gen de luciferasa de escarabajo lucOR en diversas bacterias gram
negativas. Para atenuar la expresión en el ambiente donde la cepa marcada tiene
que sobrevivir (y permitir la detección sensible cuando lo deseemos), un
fragmento de ADN conteniendo el gen represor lacIq y una fusión
Ptrc::lucOR se clonaron dentro de los plásmidos suicidas mini-Tn5.
Estas construcciones son capaces de expresar altos niveles de luciferasa solo
cuando se inducen con IPTG. Las cepas con las inserciones mini-Tn5-lucOR
mostraron altos niveles de actividad luciferasa inducidas por la adición de
IPTG. La fuerza de la regulación y la intensidad de la emisión de luz dependía
de la cepa marcada. Estos sistemas desarrollados con los transposones min-Tn5
y los genes informnadores luc y lucOR permitieron un mantenimiento
estable del gen marcador y un control seguro de la expresión de luciferasa en
el ambiente (11).
Aunque
el uso de los microorganismos manipulados genéticamente parece prometedor en
situaciones en las que los tratamientos con procesos fisicoquímicos son
impracticables y los contaminantes son insensibles a la microbiota autóctona,
no existe suficiente conocimiento sobre los posibles efectos no deseables
derivados de este uso, tales como la persistencia de los GEMs o la transferencia
de genes a otros microorganismos (12). La mayoría de los objetivos de los
experimentos sobre interacciones genéticas en el suelo están enfocados hacia
la detección de transferencia conjugativa, el cual es considerado como el mayor
proceso responsable de transferencia génica (13). La liberación deliberada de
estos GEMs puede tener consecuencias impredecibles para el ambiente, por lo que
es necesario el estudio de las interacciones microbianas y especialmente de las
cepas introducidas y su ADN recombinante. Esta preocupación ha sido expresada
no solo por la supervivencia de los GEMs en el ambiente sino también por la
diseminación de sus secuencias de ADN manipuladas. Los microorganismos indígenas
actuando como cepas receptoras de las secuencias de ADN manipuladas genéticamente
adquieren nueva información, y la adquisición de plásmidos algunas veces
parece ser la causa de las alteraciones fisiológicas (14).
El objetivo de este estudio ha sido establecer un sistema modelo para el análisis
de transferencia de plásmidos, basándonos en construcciones desarrolladas con
el promotor derecho del fago lambda y los genes de luciferasa luc y lucOR.
Este promotor, [[lambda]]PR, es regulado por el represor termosensible cI857,
el cual a 28[[ordmasculine]]C se encuentra de forma reprimida, inactivándose la
proteina represora a 42[[ordmasculine]]C y dando lugar a la inducción del
promotor. Usamos un sistema desarrollado en nuestro laboratorio con genes de
luciferasa: cI857-[[lambda]]PR::luc y cI857-[[lambda]]PR::lucOR,
el cual demostramos que es inducible por temperatura en E. coli, con la
particularidad de que cuando lo transferimos a otras especies gram negativas
como por ejemplo P. pútida, R. meliloti, A. faecalis,
etc., el represor no tiene operatividad, mostrándose por lo tanto de forma
constitutiva a 28[[ordmasculine]]C y pudiéndose detectar la luz producida tanto
por genes luc como por genes lucOR (9), sirviendo por lo tanto de
informador cuando la transferencia es positiva. Debido a esto es posible también
utilizar el color de ambos genes de luciferasa (verde y naranja) a la hora de
realizar estudios de transferencia. Hemos estudiado la frecuencia de
transferencia de plásmidos derivados de RK2, grupo de incompatibilidad IncP
(pACR4 y pACR18) y de R388, grupo de incompatibilidad IncW (pET2), tanto in
vitro en el laboratorio como en microcosmos de suelo estéril y no estéril.
1.
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